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摘要：近年來，隨著低值大宗氨基酸產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)逐漸向發(fā)展中國家轉(zhuǎn)移，我國已成為世界氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)大國，氨基酸需求量不斷增加，應(yīng)用范圍不斷拓展。由于氨基酸發(fā)酵屬于技術(shù)密集型產(chǎn)業(yè)，涉及的化工單元操作比較多，因此，保證關(guān)鍵工藝參數(shù)的可控性和重現(xiàn)性對連續(xù)自動化生產(chǎn)至關(guān)重要。為了提高發(fā)酵過程分析和控制水平，提高產(chǎn)品產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率，采用基于化學(xué)計量學(xué)的近紅外光譜技術(shù)的分析過程，建立一個穩(wěn)定、可靠的氨基酸發(fā)酵過程預(yù)測模型，實時監(jiān)測發(fā)酵過程中各參數(shù)的濃度，為氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)過程優(yōu)化與自動化控制奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：近紅外光譜；化學(xué)計量學(xué)分析；氨基酸發(fā)酵；預(yù)測模型

一、引言

近年來，隨著低值大宗氨基酸產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)逐漸向發(fā)展中國家轉(zhuǎn)移，我國已成為世界氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)大國，氨基酸需求量不斷增加，其應(yīng)用范圍不斷拓展。當(dāng)前，發(fā)酵過程分析的重點問題是及時地自動監(jiān)測各大關(guān)鍵工藝參數(shù)，對數(shù)據(jù)的最終結(jié)果進行統(tǒng)計、整理、分析，同時要反映出實際控制工藝的整體操作環(huán)節(jié)，切實保障批次之間的控制工藝能夠統(tǒng)一，產(chǎn)品的品質(zhì)無可挑剔，降低廢品出現(xiàn)的可能性，節(jié)省勞動力方面的支出以及避免人力所導(dǎo)致的誤差，落實及時化的產(chǎn)品通過幾率，大大縮減整體生產(chǎn)周期，這將更有益于工藝優(yōu)化以及交接。近年來，近紅外光譜技術(shù)廣泛地應(yīng)用在發(fā)酵領(lǐng)域的諸多方面，主要集中在發(fā)酵底物和終產(chǎn)品的檢測方面，而應(yīng)用于發(fā)酵過程監(jiān)測和自動控制的研究基本處于空白。

（一）氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)

氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)歸根結(jié)底來說屬于技術(shù)密集型產(chǎn)業(yè)，它所觸及的化工單元操作極為繁多，西方發(fā)達(dá)國家以往常用的間斷型非持續(xù)化的制造方法已逐步被替換為效率顯然更優(yōu)化的連續(xù)化自動生產(chǎn)方法。國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)業(yè)在控制技術(shù)層面上一般表現(xiàn)得較為滯后，制造階段依然將人力控制作為常有的方式，電腦技術(shù)的運用起始時間相對比較晚，普及率也極為一般。針對氨基酸發(fā)酵這一問題來說，明確保障關(guān)鍵工藝參數(shù)本身的可操控特性以及重現(xiàn)特性對于連續(xù)化自動生產(chǎn)而言極為必要。氨基酸發(fā)酵的整體過程的要點大體上被歸納為如下內(nèi)容：

第一，在各方面始終堅持純培養(yǎng)，包括設(shè)備、培養(yǎng)液以及空氣滅菌處理：對于發(fā)酵的整體過程而言，不管是屬于分批次的發(fā)酵還是連續(xù)性的發(fā)酵，其第一大準(zhǔn)則就是在實操進行期間內(nèi)一定要堅持純培養(yǎng)，唯有堅持這一點方能確保常規(guī)化的生產(chǎn)過程，氨基酸發(fā)酵亦不能區(qū)別對待。

第二、對發(fā)酵過程實施整體的控制，比如pH、溫度、通氣以及消泡沫：對發(fā)酵過程實施控制的目的是要令其保障菌體能夠用最佳速度發(fā)育，并實現(xiàn)其產(chǎn)物的無異?；铣?/span>^[1]。發(fā)酵過程從根本上能夠劃分成兩個重要的階段：一個是生長期(即從細(xì)胞初始化地生長直至指數(shù)生長完為止)，一個是生產(chǎn)期(即指數(shù)生長完直到細(xì)胞開啟代謝過程并累積了氨基酸為止)。

第三、產(chǎn)物的形成(溶氧以及代謝)：氨基酸的發(fā)酵其實是消耗氧氣的一個過程，因此，產(chǎn)物生產(chǎn)和溶氧之間有著極大的關(guān)聯(lián)^[2]，諸如此類的氨基酸發(fā)酵過程避免不了地需要足量的氧氣，使其符合細(xì)胞呼吸的條件，發(fā)酵液所具有的溶氧壓力則必須要維持在0.0003的大氣壓以上方可獲得高產(chǎn)量。

（二）近紅外光譜分析技術(shù)

近紅外光譜分析技術(shù)（Near Infrared Spectroscopy）作為“綠色檢測技術(shù)”克服了傳統(tǒng)分析方法檢測速度慢、樣品處理步驟復(fù)雜等缺點，被廣泛應(yīng)用于制藥、食品、石油化工等領(lǐng)域。該技術(shù)可根據(jù)有機物含氫基團（主要包括C-H，N-H，O-H，S-H）對近紅外光譜吸收的差異區(qū)分不同物質(zhì)并測定其濃度。NIR光譜儀擁有多種檢測終端，如光纖探頭、液體流通池、積分球等，可以采用透射（透反射、漫透射）、反射（漫反射）等檢測方法進行測定。NIR測定對樣品要求簡單，可以直接測定（一般不進行預(yù)處理或者簡單預(yù)處理，如除氣和過濾等），且測定速度快，可以進行多理化參數(shù)同時分析，結(jié)果可靠，非常適合生產(chǎn)中的PAT要求^[3]。NIR光譜技術(shù)在生物發(fā)酵應(yīng)用場景整體組成如圖1所示。

圖1 NIR光譜技術(shù)在生物發(fā)酵應(yīng)用場景

二、基于化學(xué)計量學(xué)的近紅外光譜技術(shù)分析

基于化學(xué)計量學(xué)的近紅外光譜分析的基本信息流程處理環(huán)節(jié)主要有：多元信息采集，多元數(shù)據(jù)關(guān)鍵特征提取及多元數(shù)據(jù)建模。根據(jù)不同環(huán)節(jié)在預(yù)測模型性能中的作用，主要有以下幾種技術(shù)分析方法。

（一）數(shù)據(jù)采集

樣本數(shù)據(jù)采集是近紅外建模分析的第一步，對預(yù)測模型關(guān)系信息和范圍信息起決定性作用。實際信息采集過程通常包括三個環(huán)節(jié)：代表性樣本選擇、光譜信息測量和參比值測量。因此，從以下幾個方面進行數(shù)據(jù)采集方法的介紹。

1、選擇代表性樣品

選擇具有一定范圍的樣品類型信息，其中樣品的化學(xué)范圍信息構(gòu)成參比值的結(jié)構(gòu)范圍，濃度成分范圍和物理空間范圍分別構(gòu)成樣品的濃度范圍和空間范圍。簡單說，就是選擇樣品時需要同時考慮深度和縱度，其中深度表示參比值的大小范圍，縱度則表示相同濃度下不同產(chǎn)地或產(chǎn)區(qū)樣品的數(shù)目。

2、測定光譜數(shù)據(jù)

 建模數(shù)據(jù)集中通常包含確定信息和不確定信息，其中確定信息是預(yù)測模型關(guān)聯(lián)中對應(yīng)于參比值的光譜特征，其可靠程度決定了預(yù)測模型的準(zhǔn)確度和精確度。確定信息測量一般需要考慮儀器校正、預(yù)熱、樣品擺放、光纖是否損壞、燈源（特指鹵鎢燈）是否有效等等，而不確定信息一般是指光譜數(shù)據(jù)集中各樣品光譜測定所用的儀器參數(shù)、進樣參數(shù)與環(huán)境參數(shù)等可能變動的信息，這些不確定信息的變動范圍決定了預(yù)測模型應(yīng)對樣品光譜測量時的應(yīng)變能力，即決定了預(yù)測模型的穩(wěn)健性。

3、測定參比值

所有光譜定量分析預(yù)測模型的基礎(chǔ)是建立光譜變量和參比值之間的關(guān)系預(yù)測模型，但是近紅外屬于間接測量，其參比值通過標(biāo)準(zhǔn)物樣品的真值獲得，而實際分析過程中則通常是采用標(biāo)準(zhǔn)方法測定建模樣品中的樣品參比值，不同實驗人員的操作規(guī)范性、實驗環(huán)境以及儀器的校正使用都對分析結(jié)果產(chǎn)生隨機誤差和系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致獲取的參比值通常含有誤差。

（二）數(shù)據(jù)處理與關(guān)聯(lián)分析

實驗獲取的近紅外光譜數(shù)據(jù)在建模之前需要進行預(yù)處理，目的是提高數(shù)據(jù)質(zhì)量；然后，進行特征工程以壓縮信息規(guī)模，進而提高信息表征能力；最后，基于化學(xué)計量學(xué)建模分析預(yù)測模型。

1、 數(shù)據(jù)預(yù)處理

數(shù)據(jù)預(yù)處理包括很多方面，譬如異常樣本剔除、光譜背景校正、去噪、樣本范圍確定以及樣品參比值正態(tài)分布檢驗。首先，需要考慮異常樣本剔除問題，通常來說，光譜吸光度、參比值偏大或偏小的一般屬于異常樣本，如果兩者同時偏大或偏小，則有可能是異常樣本，也有可能是范圍邊緣樣本，此時需要謹(jǐn)慎對待；然后，對剔除異常樣本的數(shù)據(jù)進行光譜預(yù)處理，主要有歸一化、移動窗口平滑、 SavitZky-Golay（SG）卷積平滑、 SG求導(dǎo)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正（SNV）和多元散射校正（MSC）等^[4-9]，下一步根據(jù)文獻(xiàn)確定分析變量的范圍，最終確定建模樣本。

2、數(shù)據(jù)特征工程

預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)維度較高，無法直接進行建模分析，需要進行變量的特征工程處理確定特征變量。特征工程泛指從數(shù)據(jù)中提取需要的特征變量，現(xiàn)有的方法主要有偏 最 小 二 乘 （Partialleast Squares, PLS）、主 成 分 分 析 （Principal Component Analysis，PCA）、線性 判 別 分 析 （Linear Discriminant Analysis，LDA）、正交線性判別分析（Orthogonal Linear Discriminant Analysis，OLDA）等不同方法^[10-12]，針對不同的對象可采用合適的方法。其中，PCA是目前應(yīng)用范圍較廣的分析方法之一，但是其解釋性較弱，現(xiàn)在也有應(yīng)用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和循環(huán)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)做近紅外光譜分析的，結(jié)果通常比較漂亮，但是很難用數(shù)學(xué)去表達(dá)其處理過程。

3、建模與模型應(yīng)用

近紅外預(yù)測模型的最后一步是建模分析及應(yīng)用，其中建模過程是指建立特征和參比值矩陣的關(guān)聯(lián)模型，分為線性和非線性方法，對于基于儀器的預(yù)測模型而言，所有的工作都集合在一起，整個過程全部都按照設(shè)定程序執(zhí)行；對于預(yù)測模型應(yīng)用，通常需要確定分析樣品光譜是否在分析范圍之內(nèi)。

按照上述思路，基于化學(xué)計量學(xué)近紅外光譜分析的基本技術(shù)思路是：建立與應(yīng)用容變性的關(guān)系模型，以解決光譜變動對分析結(jié)果的影響。其中，容變性模型是指關(guān)系模型的關(guān)系可靠性與模型分析范圍的容變性，即前面所述的關(guān)系信息和范圍信息。由圖2可知，相比于常規(guī)光譜分析，近紅外光譜分析過程在建立關(guān)系模型的同時，也需要采集與處理模型范圍信息，并根據(jù)分析結(jié)果進行反向優(yōu)化模型結(jié)構(gòu)和模型參數(shù)等，實現(xiàn)模型優(yōu)化。

圖2 常規(guī)光譜分析與近紅外光譜分析技術(shù)思路對比

三、近紅外光譜技術(shù)在氨基酸發(fā)酵過程應(yīng)用

（一）近紅外光譜對色氨酸發(fā)酵L-色氨酸質(zhì)量濃度定量分析預(yù)測

文獻(xiàn)^[13]提出將偏最小二乘算法（PLS）L-色氨酸近紅外光譜預(yù)測模型作為實驗參考對象；采用Tensor37傅里葉近紅外分析儀采集發(fā)酵液近紅外光譜L-色氨酸樣本，采用11種預(yù)處理方法處理，選擇不同預(yù)處理下最合適波數(shù)范圍，結(jié)合PLS算法以及的條件下建立最優(yōu)L-色氨酸濃度定量分析預(yù)測模型。表1展示了不同光譜預(yù)處理方式對應(yīng)的預(yù)測模型性能評估指標(biāo)結(jié)果值。

表1  不同光譜預(yù)處理條件下的L-色氨酸濃度最優(yōu)模型

從表1可知，最終選擇模型的構(gòu)建方法為：預(yù)處理方法為二階導(dǎo)數(shù)，波數(shù)范圍為6101.8-5450cm^-1，再結(jié)合偏最小二乘算法建立校正模型。二階導(dǎo)數(shù)可以消除由于氣泡、細(xì)胞的懸濁物存在所引起的基線漂移，加強光譜的微小差異。

（二）近紅外光譜對谷氨酸發(fā)酵乳酸質(zhì)量濃度定量分析預(yù)測

文獻(xiàn)^[14]采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘的方法建立并優(yōu)化谷氨酸溫度敏感突變株發(fā)酵過程中乳酸濃度預(yù)測模型。首先，采用近紅外分析軟件OPUS7.0分別在全圖譜和波數(shù)為6000-8000 cm^-1條件下利用原始光譜和不同光譜預(yù)處理方式，建立和優(yōu)化發(fā)酵液中乳酸濃度校正模型，所得各模型參數(shù)如表2所示。

表2 不同光譜預(yù)處理和波數(shù)范圍條件下乳酸濃度最優(yōu)模型

從表2可知，作為評價模型的重要指標(biāo)，RMSECV值越小，說明所建模型的預(yù)測能力越強；對全圖譜范圍及不同預(yù)處理條件下各模型RMSECV值分析后可知，當(dāng)預(yù)處理為1^st+SNV時RMSECV值、RPD值以及決定系數(shù)（R²）分別為0.822g/L、3.5和0.753，優(yōu)于其他模型；而在波數(shù)為6000-8000cm^-1范圍內(nèi)，預(yù)處理為1^st+SNV時RMSECV值最?。?/span>0.544g/L），說明全圖譜中含有大量噪音，對模型有一定影響，而在6000-8000cm^-1范圍內(nèi)有利于提取光譜有效信息，適合模型的建立。表3展示了在光譜預(yù)處理為1^st+SNV條件下，選擇不同波數(shù)范圍進一步優(yōu)化乳酸濃度校正模型各項參數(shù)結(jié)果。

表3  1^st+SNV條件下不同波數(shù)范圍對乳酸濃度模型的影響

從表3可知，模型28中RMSECV值（0.482g/L）低于其他模型，R²為0.912，較模型18有所提高。因此，5500-6000cm^-1和4200-4900cm^-1兩個特征區(qū)域所蘊含的有效信息有利于模型優(yōu)化。因此，結(jié)合偏最小二乘的方法，在光譜預(yù)處理為一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化（1^st+SNV）、波數(shù)為5500-7500cm^-1+4200-4900cm^-1條件下獲得最優(yōu)乳酸濃度預(yù)測模型。

（三）近紅外光譜對異亮氨酸發(fā)酵異亮氨酸質(zhì)量濃度定量分析預(yù)測

文獻(xiàn)^[15]提出利用近紅外分析儀和相關(guān)近紅外軟件，建立谷氨酸棒桿菌發(fā)酵過程中異亮氨酸質(zhì)量濃度的近紅外預(yù)測模型；采用近紅外分析軟件OPUS7.0，分別在全波長和7400-9100cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)選擇原始光譜和不同光譜預(yù)處理的方法，建立異亮氨酸質(zhì)量濃度PLS最優(yōu)校正模型，模型各項參數(shù)結(jié)果如表4所示。

表4 不同光譜預(yù)處理的異亮氨酸質(zhì)量濃度模型

由表4可知，在相同光譜預(yù)處理條件下7400-9100cm^-1波數(shù)范圍內(nèi)所建立模型RMSECV值均小于全波長；當(dāng)光譜預(yù)處理為減去一條直線時，相比其他預(yù)處理RMSECV值最小為1.73g/L，決定系數(shù)達(dá)到0.997，因此，結(jié)合偏最小二乘法，在波數(shù)為7400-9100cm^-1，減去一條直線作為光譜預(yù)處理的條件，獲得異亮氨酸質(zhì)量濃度最優(yōu)近紅外近紅外預(yù)測模型。

四、近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用前期與展望

近紅外光譜技術(shù)在氨基酸發(fā)酵過程中以物質(zhì)濃度預(yù)測模型為基礎(chǔ)，可以結(jié)合代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析結(jié)果、分析菌體生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)消耗的動力學(xué)特征，以溫度、PH值、攪拌轉(zhuǎn)速及溶解氧濃度等環(huán)境變量為狀態(tài)變量，以底物、重要中間代謝物及目標(biāo)產(chǎn)物等生化指標(biāo)變量為證據(jù)變量，基于合適時間單位對不確定性、非線性的發(fā)酵過程進行實時建模。為了更好的檢測氨基酸發(fā)酵過程中底物消耗、產(chǎn)物積累等數(shù)據(jù)，基于化學(xué)計量學(xué)可以逐步建立和調(diào)整獲得最優(yōu)化的氨基酸發(fā)酵過程參數(shù)模型數(shù)據(jù)庫；在發(fā)酵過程中引入近紅外光譜技術(shù)可以提高生產(chǎn)過程可控性，實現(xiàn)生產(chǎn)的連續(xù)化，降低成本、提高生產(chǎn)效率，使得產(chǎn)品更加符合GMP要求。

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